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Examinando Maestrías por Autor "Acosta Hoyos, Luis David"
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Ítem Diseño y estandarización de una técnica para la amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) para la detección del gen BCR-ABL1 en Leucemia Mieloide crónica (LMC)(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2023) Acosta Hoyos, Luis David; Garcés Viloria, Arelys; Ruiz Benítez, Martha Lucia; Bello Lemus, YesidLa leucemia mieloide crónica (LMC) se define como un síndrome mieloproliferativo crónico de origen clonal, que se genera de una célula madre, como consecuencia de la producción descontrolada de una proteína cinasa única BCR-ABL1 constitutivamente activa, generando un excesivo número de células mieloides en todos los estadios de maduración. Un diagnóstico rápido y costo efectivo de la enfermedad favorecería una intervención oportuna, evidenciada en la selección del tratamiento y traducido en una mejoría en la calidad de vida. En el presente estudio se estandarizará la técnica LAMP para el diagnóstico clínico de leucemia mieloide crónica a través de la detección del gen BCR-ABL1. Actualmente el diagnóstico molecular de Leucemia mieloide crónica (LMC) se realiza a través de la técnica RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa), la cual es una técnica sensible y específica, sin embargo es compleja, laboriosa y requiere de termocicladores que permitan realizar variaciones en la temperatura para que ocurra la reacción de amplificación; la técnica LAMP, amplificación isotérmica mediada por lazos, es una reacción mucho más rápida y más práctica que la PCR, debido a que es llevada a cabo empleando una única temperatura, que puede ser otorgada por cualquier equipo que garantice la temperatura por al menos 30 minutos. De manera que, en mucho menor tiempo comparado con la RT- PCR se lograría tener una alternativa eficaz que mejoraría el pronóstico de la enfermedad y conduciría a mejores estrategias de tratamiento de los pacientes con LMC. Para lo cual se diseñó un estudio metodológico de la estandarización de una prueba diagnóstica a través de un estudio transversal de la amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) para detección del gen BCR-ABL1 en Leucemia Mieloide crónica (LMC), que incluye un grupo de muestras de pacientes que padece la enfermedad, considerado caso y otro grupo que no tiene la enfermedad, controles. Los resultados son comparados con una prueba de referencia o Gold Standard (Rt- PCR). Se seleccionaron 5 muestras positivas con diagnóstico molecular conocido por RT-qPCR para el gen BCR-ABL1 y 5 muestras negativas con diagnostico conocido por RT-qPCR para el gen BCR- ABL1. Cada muestra fue procesada por triplicado, luego se realizó la extracción del ARN. Los ARN extraídos de las muestras positivas y negativas verificadas previamente por RT-qPCR se usaron para llevar a cabo la reacción RT-LAMP. Con el fin de estandarizar el tiempo óptimo del cambio de color de la reacción, la prueba LAMP se incubó a diferentes tiempos, 30, 35, 40 y 45 minutos. El cambio de color de rosa al amarillo fue indicativo de una reacción positiva. En las reacciones que se mantuvo el color rosa del reactivo LAMP fue señal de negatividad para el gen BCR- ABL1. Cada muestra extraída se procedió a procesar por triplicado obteniéndose un total de 30 repeticiones. Con la finalidad de obtener un producto puro de gen BCR- ABL y posteriormente poder realizar una cuantificación más exacta de este, se realiza PCR para lograr la amplificación el gen BCR-ABL1 esperando un fragmento de 500 pb empleando los primers: Forward: 5´AATCATATGCTGTCGGGAATCCTGGCTA 3´, Revers: 5´AATCATATGAGTGCAACGAAAAGGTTGGG 3´ y se realizó una RT- PCR. A partir del amplificado se realizó un corrido electroforético para confirmar el peso del producto obtenido, empleando gel de agarosa al 1 % a 80 voltios por 60 minutos, usando un marcador de peso molecular de 500 pb. Con el propósito de obtener más producto del gen (BCR-ABL) y posteriormente cuantificarlo para poder lograr establecer la sensibilidad de la prueba, se realizó una segunda PCR convencional a partir del producto amplificado. Las condiciones de la amplificación fueron: 1 ciclo de 95°C por 1 minuto,40 ciclos de 95°C por 15 segundo, 64 °C por 30 segundos y 72°C por 2 minutos, seguido de una extensión final a 72°c por 10 min. Se verificó la amplificación del producto a partir de electroforesis en gel de agarosa al 1%, a 80 voltios por 80 minutos. Del producto purificado se realizó una verificación de la concertación a través de NanoDrop. La sensibilidad se expresó como la fracción de muestras que resultaron positivas en la PCR y, también, en la RT-LAMP. La especificidad de la prueba RT-LAMP se calculó de la fracción de muestras con RT-qPCR negativas que también resultaron negativas en las pruebas de RT-LAMP. Se calculó el valor predictivo positivo y el negativo, además del índice kappa (κ) para determinar la concordancia de los resultados de la RT-LAMP con los de la RT- qPCR. Se observó que todas las muestras incluyendo el control negativo (agua en lugar de muestra de ARN) se mantenían color rosa, por lo que se sugirió que el tiempo de 30 minutos no fue suficiente para detección de al menos una muestra positiva. Se realizó incubación isotérmica 65°C por 35 minutos a las mismas muestras y se observó el mismo comportamiento, ninguna muestra resultó positiva para el gen BCR-ABL1, por lo que este tiempo tampoco fue suficiente para detectar el BCR- ABL1 por RT-LAMP. Se incubó por 40 minutos, obteniéndose un ligero cambio de color en 3 muestras, el resto de las muestras incluyendo el control negativo, permanecían color rosa. Se incubó por 45 minutos y se observó que 5 de las muestras evaluadas en la corrida cambiaron de color, de rosa a amarillo, y 5 muestras permanecían color rosa al igual que el control negativo. por lo que se estableció que 45 minutos es el tiempo necesario de la reacción isotérmica RT-LAMP para detección del gen BCR-ABL1. De los ensayos anteriores se obtuvo una sensibilidad y especificidad del 100% en las muestras evaluadas pudiendo discriminar entre pacientes y controles.