Examinando por Autor "Machado Sierra, Elwi Guillermo"
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Ítem Bacterias solubilizadoras de fosfato: efectos sobre cultivos de importancia económica(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2018) Narváez Gutiérrez, María Claudia; Ávila Ucros, Nelson Antonio de; Pérez-Lavalle, Liliana; Machado Sierra, Elwi GuillermoLa utilización de microorganismos para mejorar los rendimientos de los cultivos y minimizar el uso de fertilizantes químicos es una estrategia promisoria. En este sentido, las bacterias solubilizadoras de fosfato se posicionan como una buena alternativa para disminuir el uso de estos fertilizantes y promover a su vez el crecimiento vegetal. El objetivo de este trabajo fue ofrecer una perspectiva actualizada del efecto de inóculos bacterianos con capacidad solubilizar en diferentes cultivos. Para esto se llevó a cabo una revisión en diferentes bases de datos; la mayoría de los estudios se direccionaron a cultivos como el maíz y el trigo; asimismo, los resultados arrojaron que los géneros Pseudomonas, Burkholderia y Bacillus se destacan como potenciales promotores de crecimiento vegetal que pueden ser incluidos en la formulación de biofertilizantes obteniendo un producto agrícola de calidad y sin generar consecuencias al ambiente.Ítem Candidatus liberibacter asiaticus en citricultivos(Ediciones Universidad Simón Bolivar, 2021) Baza Bermúdez, Nicolle Esther; Escobar Díaz, Jessica María; Herrera Yepes, Andrés Elias; Aranguren Díaz, Yani Cristina; Machado Sierra, Elwi GuillermoLos frutos cítricos desempeñan un papel importante en la alimentación de millones de personas a nivel mundial, ya que son cultivos permanentes y poseen alta adaptabilidad a diversas condiciones climáticas. Existen numerosas enfermedades que afectan a los cítricos, de origen viral, fúngica, bacteriana o parasitaria. Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) es una bacteria Gram negativa que tiene la capacidad de alojarse en los tubos del tamiz del floema, lo que le permite moverse por toda la planta, para ubicarse en órganos con alta demanda de nutrientes. CLas es trasmitida por el insecto vector Diaphorina citri por medio del cual logra afectar a diferentes cultivos pertenecientes a la familia Rutaceae y causar la enfermedad conocida como Huanglongbing (HLB) o “enfermedad del dragón amarillo”. CLas altera funciones metabólicas de los carbohidratos celulares en plantas de cítricos; lo que produce la acumulación de almidón, sacarosa y glucosa, afectando el flujo de nutrientes en toda la planta y disminuyendo su capacidad fotosintética. El problema fitosanitario central radica en la dificultad de cultivar a CLas, por ser una bacteria fastidiosa, generando una demanda especial atención de estudio y búsqueda de métodos de diagnóstico y control de la enfermedad HLB. Por este motivo, el objetivo de este trabajo fue conocer la biología de Candidatus Liberibacter asiaticus. Para ello se realizó una revisión sobre sobre CLas y la enfermedad en Colombia. Además, se realizó un análisis bioinformático de los genes 23S y 16S. A partir de este se determinó que según 23S existen similitudes entre Oricola thermophila y según 16S Devosia spp., que se observó en agrupamientos basados en diferentes métodos, donde se mantuvo siempre la estructura topológica de este clado. La información recopilada y las secuencias analizadas reafirman la necesidad de conocer mejor el estado etiológico del HLB, en particular la caracterización genética, que permita manejar y controlar esta enfermedad que ha afectado tanto la citricultura del mundo entero.Ítem Caracterización de bacterias halófilas y sus mecanismos morfológicos, provenientes de suelos hipersalinos del caribe colombiano (La Guajira)(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2022) Parejo Solano, Franklin Junior; Osorio Fernández, María Gabriela; Machado Sierra, Elwi Guillermo; Aranguren Diaz, Yani CristinaLa salinidad presente en distintos ambientes puede ocasionar problemas que interfieren en el desarrollo y en la absorción de nutrientes, como es en el caso de los suelos, debido a que en estas condiciones el potencial osmótico del suelo supera al del sistema radicular de las plantas, produciendo limitaciones en la entrada del agua en la raíz. Es por esto qué se buscó un potencial biorrecuperador a base de bacterias promotoras de crecimiento vegetal, con el fin de recuperar los suelos que sufren de esta problemática. El estudio realizado tuvo como finalidad el aislamiento de bacterias halotolerantes de sedimento de las salinas de Manaure (La Guajira). Inicialmente se realizó la estandarización del cultivo bacteriano con el medio mínimo IRAM a diferentes concentraciones de cloruro de sodio (0M, 0.5M, 1M, 1.5M, 2M, 2.5, 3M, 3.5M y 4M), e incubadas a 28°C, durante 48 horas con observaciones cada 24 horas. Posteriormente, se realizaron curvas de crecimiento bacteriano y de cada aislado seleccionado se llevaron a cabo pruebas de actividad proteolítica, celulolítica, lipolítica, fijación de nitrógeno y solubilización de fosfato, con la finalidad de identificar su potencial como bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Además, se hizo extracción de ADN, PCR y secuenciación del gen ARNr 16s para la identificación de cada aislado. Se seleccionaron los aislados que presentaron crecimiento en el medio IRAM con concentraciones superiores de NaCl 2M. El análisis de filogenia de uno de los aislados obtuvo como resultado Halomonas spp. Estos microorganismos tienen un gran potencial biotecnológico, por la producción de algunos solutos compatibles que les concede la capacidad para estabilizar los suelos en la agricultura, estos no solamente producen compuestos de enorme interés industrial, como enzimas, biopolímeros o solutos compatibles, además presentan propiedades fisiológicas que proporcionan su explotación comercial.Ítem Elaboración de bioinsumos para diagnóstico de biología molecular mediante la síntesis de nanopartículas magnéticas y la sobreexpresión de proteínas.(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2023) Rincón Mendoza, Laura Vanessa; Castellar Vergara, Ramiro José; Negrete Julio, Alexey Alberto; Machado Sierra, Elwi Guillermo; Pacheco Londoño, Leonardo CarlosLa pandemia del SARS-CoV-2 ha dejado una huella imborrable en la conciencia global, no solo en términos de salud pública, sino también en la percepción de la autonomía y la dependencia tecnológica en diversos sectores. Uno de los aspectos más reveladores de esta dependencia ha sido la escasez de suministros esenciales, particularmente los kits diagnósticos para el SARS-CoV-2. En un abrir y cerrar de ojos, estos kits se convirtieron en un bien preciado, una herramienta vital para detectar y rastrear el virus. Sin embargo, la producción nacional no pudo estar a la altura de la creciente demanda, lo que puso en evidencia la vulnerabilidad de depender en gran medida de insumos extranjeros en tiempos de crisis. Fue en este contexto que surgió la necesidad de buscar una solución local y autónoma para abordar esta carestía de suministros críticos. En esta búsqueda de autonomía biotecnológica, se decidió estandarizar una metodología que permitiera la sobreexpresión heteróloga de la enzima polimerasa de Thermus aquaticus, o Taq pol. Esta enzima desempeña un papel crucial en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica ampliamente utilizada en la amplificación del material genético. La decisión de sobreexpresar la Taq pol tenía como objetivo reducir la dependencia de la importación de esta enzima y, al mismo tiempo, fortalecer la capacidad de llevar a cabo pruebas de diagnóstico a nivel local. El proceso comenzó con la obtención de un vector de expresión denominado pOPENTaq, que incluía un promotor inducible con IPTG y un gen de resistencia a la ampicilina. Este vector se usó para transformar bacterias de Escherichia coli BL21, con el objetivo de lograr la sobreexpresión de la Taq pol. Simultáneamente, se llevó a cabo la estandarización de un protocolo eficiente para la extracción de plásmido, una molécula de ADN circular que se utiliza en la clonación y otras aplicaciones biotecnológicas. La transformación se verificó mediante el crecimiento bacteriano en un medio LB suplementado con ampicilina. Sin embargo, en estas etapas iniciales del proyecto, no se logró la sobreexpresión funcional de la Taq pol. Como resultado, se tomó la decisión de cambiar a una cepa diferente de E. coli, conocida como E. coli Rosseta (DE3), que es resistente al cloranfenicol y, según la literatura, presenta una maquinaria de expresión más eficiente. Este cambio tenía como objetivo superar las limitaciones observadas en la sobreexpresión de la proteína esencial para la PCR. El siguiente paso en este proceso involucra la purificación y concentración de la enzima Taq pol una vez que se logre su sobreexpresión en E. coli Rosseta (DE3). Esto implica la aplicación de técnicas de laboratorio para separar y refinar la enzima, asegurando que esté libre de contaminantes y en una concentración adecuada para su uso en aplicaciones de PCR. Una vez que se haya completado con éxito la purificación y concentración de la enzima, se procederá a evaluar su actividad de polimerización mediante una PCR. Este proceso implica utilizar la enzima Taq pol purificada en una reacción de PCR para amplificar una región específica de ADN, lo que permitirá confirmar su funcionalidad. Mientras tanto, en paralelo a estos esfuerzos para lograr la autonomía en la producción de Taq pol, se llevó a cabo un proyecto destinado a abordar otra faceta crítica de la dependencia biotecnológica. Con el objetivo de lograr una extracción de ADN más eficiente y rápida, se planteó la síntesis de nanopartículas magnéticas (NPM) a partir de una solución de FeCl3 y FeCl2. Las NPM se diseñaron con características específicas para la extracción de ácidos nucleicos y se estandarizó el protocolo de síntesis para obtener partículas de 5-20 nm de tamaño. Estas NPM se utilizaron para optimizar una metodología de extracción de ADN genómico bacteriano. Comparando esta metodología con las soluciones comerciales que emplean NPM o columnas de sílice, se logró reducir significativamente el tiempo de trabajo, lo que presentó ventajas evidentes en términos de eficiencia y ahorro de costos. No se necesitaba el uso de equipos costosos, como las centrifugas, lo que hacía que esta metodología fuera especialmente atractiva para aplicaciones en entornos con recursos limitados. La eficacia de este protocolo polivalente para la extracción de ADN se validó mediante la cuantificación del ADN utilizando espectrofotometría de luz UV. La electroforesis en gel de agarosa reveló la presencia de ADN íntegro y de alta calidad en más del 76% de las muestras analizadas, lo que subraya la utilidad de esta metodología en la obtención de ADN para su uso en diagnóstico y análisis genético. Un aspecto clave de este enfoque fue su polivalencia, ya que servía como base para la extracción de ARN y ADN plasmídico, ampliando aún más su utilidad en una variedad de aplicaciones de biología molecular. Esta versatilidad reveló que la síntesis autónoma de insumos es crucial para el diagnóstico y la investigación, reduciendo los gastos y el tiempo de espera en comparación con las metodologías comerciales convencionales. La capacidad de utilizar las mismas nanopartículas magnéticas para extraer tanto ácidos nucleicos como ADN plasmídico demuestra la versatilidad y el potencial de esta tecnología en diversas aplicaciones biotecnológicas. En última instancia, reconocemos que esta investigación no está exenta de limitaciones, y cada desafío encontrado ha proporcionado oportunidades para investigaciones futuras. La optimización de los protocolos de síntesis y extracción, así como la caracterización de las nanopartículas magnéticas, son áreas que merecen un seguimiento continuo. Además, la exploración de diferentes sistemas de sobreexpresión de enzimas también puede ofrecer nuevas perspectivas para mejorar la producción de Taq pol y otros componentes esenciales en biología molecular. Este trabajo no solo ha contribuido a abordar desafíos críticos en un contexto de emergencia sanitaria, sino que también ha sentado las bases para futuras investigaciones y avances en la dirección de la autonomía biotecnológica. Esperamos que inspire a la comunidad científica a continuar explorando nuevas vías de investigación y desarrollo en biotecnología y biología molecular, impulsando así la innovación en estos campos y fortaleciendo la capacidad del país para enfrentar desafíos futuros con recursos propios.Ítem Evaluación de bacterias solubilizadoras de fosfatos en suelos del bosque seco tropical del departamento Atlántico(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2019) Coronado Lora, Leidy Milagro; Romero Coronado, Andrea Cecilia; Aranguren Díaz, Yani Cristina; Machado Sierra, Elwi GuillermoIntroducción: El Bosque Seco Tropical (BST) es uno de los ecosistemas más amenazados de extinción. Las actividades antrópicas han causado trasformaciones en el suelo, contribuyendo a la alteración de la diversidad microbiana y el desarrollo vegetal. Una alternativa amigable con el planeta, para la restauración del suelo y la agricultura, es el uso de inoculantes con bacterias solubilizadoras de nutrientes. Visto así, se estudiaron suelos del BST en el departamento Atlántico, para determinar la diversidad de microorganismos solubilizadores de fosfatos, y de este modo generar una alternativa para mitigar los efectos antrópicos sobre este ecosistema y permitir su conservación y subsistencia. Materiales y Métodos: Se realizó un análisis físicoquímico y se determinó la actividad microbiana del suelo por respiración basal. La diversidad microbiana se estimó con el número de colonias diferentes y la abundancia con el número total de colonias aisladas en Agar Nutritivo y medio NBRIP. Posteriormente fueron caracterizados los aislados solubilizadores de fosfato, se realizaron pruebas de hemolisis e índice de solubilización y capacidad de fijar nitrógeno por cultivo en gota. Además, se verificó si poseen genes relacionados a la solubilización de fosfato y fijación de nitrógeno. Resultados: La respiración basal mostró pocas diferencias, el suelo intervenido fue ácido y el del bosque nativo neutro. Por otra parte, la diversidad total y de solubilizadores cultivables fue mayor en los suelos naturales. Conclusiones: Los microorganismo solubilizadores de fosfato son fundamentales para los ecosistemas. Los aislados son potenciales promotores de crecimiento vegetal que podrán ser usados en la recuperación del BST.Ítem Síntesis de columna de sílica estructurada químicamente con níquel para la purificación de proteínas con cola de poli- histidina.(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2023) Medina Santos, Hanys Saray; Machado Sierra, Elwi GuillermoLa purificación de proteínas actualmente demanda mucho interés en cuanto a su utilización para el diagnóstico de enfermedades y de uso terapéutico. Estos son capaces de resolver muchas de las necesidades científicas requeridas para la implementación de alternativas biotecnológicas y moleculares las cuales cumplen con las adaptaciones experimentales que promueven técnicas eficientes y de costos considerables, teniendo la facilidad de suplir con los resultados deseados. Los métodos para la purificación de proteína pueden considerarse altamente complejos de acuerdo a su utilización y sus requerimientos económicos, por lo que en el siguiente trabajo se empleó una alternativa estructurada químicamente a partir de la sílica cargada con Ni (II) con la posibilidad de retener a la proteína GFP a través de su cola de poli histidina suspendida en una matriz cromatográfica que busca obtener o sustituir otros métodos que requieran más gastos económicos y carezcan de ahorro de tiempo en cuanto a los resultados. Para la preparación química de la sílica se utilizaron protocolos diseñados en base a información científica y a la experiencia aportada en el centro de investigación de la Universidad Simón Bolívar Adaptia. Así mismo se puso a prueba el comportamiento de la sílica basado en la experimentación de usos de reactivos y métodos necesarios para la preparación de la sílica a base de la utilización de APS (aminopropilsilano), determinado como el proceso de silanización, fundamental para iniciar con el montaje de la estructura química con la formación de grupos aminos que a su vez son necesarios para adherir el EDTA, el cual, ayudará a desarrollar y fortalecer la superficie química a la que se desea pegar el níquel. Para la unión del EDTA a la sílica se emplearon dos mecanismos con la capacidad de lograr que a la sílica silanizada se le unieran diversos EDTA, tales como; Método por reflujo y por microondas. Además, de incorporar el sulfato de níquel y el cloruro de níquel para conseguir la adherencia de este a la matriz cromatográfica. Por otro lado, la proteína GFP requerida para probar la columna cromatográfica compuesta de sílica contaba con una cola de poli histidina, obtenida y expresada por Escherichia coli BL21, en la que solo fue necesario aplicar un protocolo de inducción con IPTG y lisis bacteriana debido a que estas ya venían transformadas con el plásmido pET28 para la obtención de GFP. Los resultados del siguiente trabajo demostraron que para la estructuración química de la sílica los protocolos más eficientes provienen del protocolo de Adherencia del EDTA a través de microondas, lo cual, fue de gran ventaja debido a que necesita menor tiempo para elaborar el proceso y es una técnica más práctica. Así mismo, la utilización del sulfato de níquel demostró ser más preciso en cuanto a la retención de GFP en la columna. Por otro lado, en el proceso final de la obtención de GFP pura se suministraron diferentes gradientes de concentración de imidazol durante la purificación, en la cual, se logró desprender a GFP de la columna y tener la proteína purificada. Por otra parte, se concluyó que es importante explorar diversas alternativas capaces de suplir y reemplazar métodos que demandan elevados costos y complejidad para su obtención, teniendo en cuenta que el fundamento y experimentación sean eficientes y recursivosÍtem Síntesis de resina de Cromatografía de Afinidad de Iones Metálicos Inmovilizados (IMAC) para la purificación de proteínas recombinantes con etiquetas de Histidina(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2024) Avila Carbono, Adan De Jesus; Lara Vargas , Guillermo Enrique; Machado Sierra, Elwi GuillermoLa purificación de proteínas es un proceso crucial en la investigación biomédica y biotecnológica, y la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) ha demostrado ser una herramienta poderosa y altamente eficaz para este fin. Esta técnica se basa en la interacción entre los grupos donantes de electrones de los residuos de histidina o cisteína presentes en la proteína de interés y los iones metálicos inmovilizados en una matriz cromatográfica. La proteína se une selectivamente a la columna IMAC, mientras que las impurezas pasan sin unirse. La proteína purificada se elude posteriormente mediante un cambio en las condiciones del buffer, rompiendo la interacción entre la proteína y el ion metálico. IMAC se utiliza ampliamente para purificar proteínas recombinantes que llevan una etiqueta de polihistidina. Esta etiqueta se fusiona genéticamente a la proteína diana durante la expresión y proporciona una alta afinidad por los iones metálicos divalentes, lo que permite una purificación eficiente y específica. La técnica es versátil y se puede utilizar para purificar una amplia gama de proteínas recombinantes de diferentes fuentes, incluyendo bacterias, levaduras, células de mamíferos y plantas. Para lograr resultados eficaces con IMAC, es importante considerar varios aspectos, como la naturaleza de la matriz cromatográfica, la selección del ligando adecuado, la concentración de iones metálicos y las condiciones del buffer. La optimización de estas variables es crucial para obtener un alto rendimiento y pureza de la proteína purificada. El proyecto de investigación descrito en el texto tiene como objetivo desarrollar un protocolo de estandarización para la síntesis de columnas de cromatografía IMAC para la purificación "in-house" de proteínas recombinantes marcadas con etiquetas de histidina. El proyecto evaluó la eficiencia de columnas previamente sintetizadas y propone un modelo a mayor escala para optimizar las variables del proceso. La estandarización de la técnica IMAC permitirá obtener columnas de alta calidad y eficiencia para la purificación de proteínas recombinantes en investigación y producción