Examinando por Autor "Pacheco Lugo, Lisandro Alfonso"
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Ítem Diversificación genética en poblaciones de Panstrongylus Geniculatus (Latreille, 1811) (Reduviidae: triatominae) de Colombia y Venezuela(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2021) Londoño Alvarez, Juan Carlos; Pacheco Lugo, Lisandro Alfonso; Pérez Doria, Alveiro JoséObjetivo: Determinar la diversificación genética en poblaciones de Panstrongylus geniculatus de Colombia y Venezuela. Metodología: se analizaron 202 secuencias del gen Cyt-b de P. geniculatus de Colombia y Venezuela, a fin de calcular índices de diversidad genética, de estructura y flujo génico, evaluar hipótesis de evolución neutral y realizar inferencias filogenéticas. Resultados: el conglomerado de P. geniculatus de Venezuela, presentó una diversidad haplotípica inferior (Hd = 0,73) respecto al de Colombia (0,93). Los pares de poblaciones Casanare-Leticia, Sucre-Santanderes y Libertador-La Guaira no presentaron estructuración genética (FST 0,05 y Nm > 1). Se registraron desviaciones de la hipótesis de evolución neutral en las poblaciones del Meta en Colombia (D* = 1,44347) y La Guaira en Venezuela (D = - 1,67405; D* = 1,82716). El análisis filogenético mostró tres grandes clados, uno exclusivo para Colombia, uno para Venezuela y uno mixto, la red de haplotipos permitió observar cuatro haplogrupos principales. Conclusiones: El haplotipo ancestral de las poblaciones de P. geniculatus pudo estar distribuido en un corredor conformado por los departamentos de Sucre, Bolívar y Santander en ColombiaÍtem Estandarización de la prueba de amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) para la detección molecular del virus del chikungunya(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2023) Bermúdez Varela, Jhonairys Adriana; Cuello Coba, Fabiana Danitza; Caballero Bolaños, Jesús Gabriel; Pacheco Lugo, Lisandro AlfonsoLas enfermedades transmitidas por vectores (ETVs) afectan a millones de personas a nivel mundial, y se estima que por eventos migratorios y cambio climático la situación epidemiológica podría empeorar. Aedes aegypti es un mosquito capaz de transmitir virus tales como, Dengue, Mayaro, Zika y Chikungunya, generando impactos significativos en salud pública. Estas enfermedades generan un espectro clínico similar, lo que complica su rápido diagnóstico por criterio clínico. Por su parte, estas infecciones pueden ocasionar brotes epidémicos que afectan a comunidades enteras, lo que conlleva a la sobrecarga de los sistemas de salud locales, agotando sus recursos y dificultando la respuesta a otras emergencias médicas. Este impacto se hace evidente al observar que, en el período comprendido entre el 1 de enero y el 4 de marzo del 2023, se reportaron 113,447 casos de chikungunya en América latina, con un total de 51 fallecidos, este número representa un aumento cuatro veces mayor en comparación con el mismo periodo de 2022 [1]. El diagnóstico molecular y definitivo del virus del chikungunya (VCHIK) usualmente se lleva a cabo por qRT-PCR, una metodología que a pesar de su sensibilidad y especificidad es impráctica en centros de salud primarios, y está centralizado al Instituto Nacional de Salud. En este trabajo nos propusimos estandarizar una metodología que fuera capaz de detectar la presencia del virus del VCHIK de manera rápida, sencilla, precisa y económica. Para ello, se optimizó la técnica de amplificación isotérmica mediada por bucles con transcripción reversa (RT- LAMP) para identificar al VCHIK mediante una reacción colorimétrica que vira de rosado a amarillo en presencia del genoma viral. En una etapa inicial de validación se evaluaron varias diluciones de ARN del VCHIK que fueron generadas in vitro, con el objetivo de determinar el límite de detección de la prueba. Adicionalmente, como una forma de validación se simuló una infección adicionando diferentes diluciones del ARN del VCHIK sintetizado in vitro en una muestra de sangre total extraída de un paciente. Luego de contar con la sangre infectada se realizó una extracción del mismo ARN de VCHIK combinado con esta; a partir de esto se determinó el límite de detección de la prueba RT-LAMP reconociendo que esta es efectiva hasta concentraciones de 0,5 atogramo (ag) en un tiempo de 30 minutos. El experimento demostró que es posible identificar el virus en un entorno clínico real. Como controles en cada una de las pruebas realizadas se incluyó ARN del virus del dengue para estimar la especificidad de la prueba, se observó que en ningún caso la prueba RT-LAMP resultó positiva para dengue. A pesar de ser un estudio preliminar y en curso, este trabajo muestra el gran potencial de la prueba RT-LAMP para la identificación molecular del virus en individuos febriles con diagnóstico presuntivo de VCHIK, lo que convierte a esta prueba en una valiosa herramienta para la vigilancia virológica de este virus, especialmente en áreas con recursos tecnológicos limitados y una infraestructura de salud insuficiente.Ítem Knockout del gen BCY84_00258 en Epimastigotes de Trypanosoma Cruzi DM28C empleando la técnica de edición génica CRISPR-CAS9(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2024) Barrios Sánchez , Camilo Andrés; Cantillo Castilla , Indira Vanessa; Pacheco Lugo, Lisandro Alfonso; Hurtado Gómez, Leidy VanessaEn el marco de la problemática de la enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruzi y el incremento en la incidencia de casos en América Latina en conjunto con el hecho de que únicamente existen dos tratamientos para el control de la enfermedad (Nufurtimox y Benznidazol), motivó la realización de un estudio de edición genética en genes constitutivos de Trypanosoma cruzi que al evaluarse su función y las consecuencias de su silenciamiento o knockout como forma de sentar las bases para estudios posteriores en los que se investiguen formas de inhibir el metabolismo parasitario y por consiguiente, la muerte del agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Es por esto por lo que como un primer acercamiento a determinar el efecto del knockout del gen BCY84_00258 en el parasito, se planteó como objetivo principal de este proyecto llevar a cabo el cleavage in vitro del gen BCY84_00258 en epimastigotes de Trypanosoma cruzi utilizando la técnica de edición génica CRISPR-Cas9. Esta investigación se enfocó en comprender el papel de este gen en la biología del parásito y evaluar su potencial como blanco para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra la enfermedad de Chagas. La metodología empleada consistió en generación de un vector plasmídico el cual contuviese la información genética necesaria para la síntesis de las moléculas involucradas en el sistema CRISPRCas, para esto se alinearon oligonucleotidos correspondientes a secuencias de DNA de aproximadamente 20pb las cuales hacen parte de la secuencia del gen de interés de forma que al ser transcritos permitan la formación de crRNA, a su vez, aguas abajo de este se introduce una secuencia que codifique para el tracrRNA, estos dos últimos forman el sgRNA necesario para dirigir la Cas9 al sitio especifico de corte. La extracción de ADN genómico de T. cruzi cepa DM28C para la amplificación e identificación del gen BCY84_00258, el cual funcionó como el DNA template para la reacción de cleavage in vitro del gen en cuestión, seguido del diseño y la producción de Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9) recombinante a partir de la clonación de bacterias E. coli Rosetta de un plásmido que contenga la secuencia de dicha endonucleasa, su sobreexpresión, extracción y purificación, garantizando la actividad de la enzima posterior al proceso. Se logró generar un sgRNA para el gen BYC84_00258. Se amplificó un fragmento de 292pb del gen BCY84_00258 con primers específicos para generar una secuencia complementaria al sgRNA generado permitiendo el corte de dsDNA por parte de la Cas9. La extracción y purificación de la Cas9 se realizó mediante FPLC, seleccionando fracciones con un valor pico >50mAU como criterio de calidad. Se llevó a cabo el cleavaje in vitro obteniéndose un corte parcial del DNA. Estos datos resaltan el potencial del gen BCY_84_00258 como gen de interés biotecnológico prometedor para el desarrollo de nuevas estrategias para la enfermedad de Chagas como la búsqueda y evaluación de moléculas que inhiban la actividad del producto proteico del gen que permitan su uso como terapia contra la enfermedad, abriendo nuevas posibilidades en la lucha contra esta enfermedad endémica de la zona tropical del continente americano.