Examinando por Autor "Negrete Julio, Alexey Alberto"
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Ítem Elaboración de bioinsumos para diagnóstico de biología molecular mediante la síntesis de nanopartículas magnéticas y la sobreexpresión de proteínas.(Ediciones Universidad Simón Bolívar, 2023) Rincón Mendoza, Laura Vanessa; Castellar Vergara, Ramiro José; Negrete Julio, Alexey Alberto; Machado Sierra, Elwi Guillermo; Pacheco Londoño, Leonardo CarlosLa pandemia del SARS-CoV-2 ha dejado una huella imborrable en la conciencia global, no solo en términos de salud pública, sino también en la percepción de la autonomía y la dependencia tecnológica en diversos sectores. Uno de los aspectos más reveladores de esta dependencia ha sido la escasez de suministros esenciales, particularmente los kits diagnósticos para el SARS-CoV-2. En un abrir y cerrar de ojos, estos kits se convirtieron en un bien preciado, una herramienta vital para detectar y rastrear el virus. Sin embargo, la producción nacional no pudo estar a la altura de la creciente demanda, lo que puso en evidencia la vulnerabilidad de depender en gran medida de insumos extranjeros en tiempos de crisis. Fue en este contexto que surgió la necesidad de buscar una solución local y autónoma para abordar esta carestía de suministros críticos. En esta búsqueda de autonomía biotecnológica, se decidió estandarizar una metodología que permitiera la sobreexpresión heteróloga de la enzima polimerasa de Thermus aquaticus, o Taq pol. Esta enzima desempeña un papel crucial en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica ampliamente utilizada en la amplificación del material genético. La decisión de sobreexpresar la Taq pol tenía como objetivo reducir la dependencia de la importación de esta enzima y, al mismo tiempo, fortalecer la capacidad de llevar a cabo pruebas de diagnóstico a nivel local. El proceso comenzó con la obtención de un vector de expresión denominado pOPENTaq, que incluía un promotor inducible con IPTG y un gen de resistencia a la ampicilina. Este vector se usó para transformar bacterias de Escherichia coli BL21, con el objetivo de lograr la sobreexpresión de la Taq pol. Simultáneamente, se llevó a cabo la estandarización de un protocolo eficiente para la extracción de plásmido, una molécula de ADN circular que se utiliza en la clonación y otras aplicaciones biotecnológicas. La transformación se verificó mediante el crecimiento bacteriano en un medio LB suplementado con ampicilina. Sin embargo, en estas etapas iniciales del proyecto, no se logró la sobreexpresión funcional de la Taq pol. Como resultado, se tomó la decisión de cambiar a una cepa diferente de E. coli, conocida como E. coli Rosseta (DE3), que es resistente al cloranfenicol y, según la literatura, presenta una maquinaria de expresión más eficiente. Este cambio tenía como objetivo superar las limitaciones observadas en la sobreexpresión de la proteína esencial para la PCR. El siguiente paso en este proceso involucra la purificación y concentración de la enzima Taq pol una vez que se logre su sobreexpresión en E. coli Rosseta (DE3). Esto implica la aplicación de técnicas de laboratorio para separar y refinar la enzima, asegurando que esté libre de contaminantes y en una concentración adecuada para su uso en aplicaciones de PCR. Una vez que se haya completado con éxito la purificación y concentración de la enzima, se procederá a evaluar su actividad de polimerización mediante una PCR. Este proceso implica utilizar la enzima Taq pol purificada en una reacción de PCR para amplificar una región específica de ADN, lo que permitirá confirmar su funcionalidad. Mientras tanto, en paralelo a estos esfuerzos para lograr la autonomía en la producción de Taq pol, se llevó a cabo un proyecto destinado a abordar otra faceta crítica de la dependencia biotecnológica. Con el objetivo de lograr una extracción de ADN más eficiente y rápida, se planteó la síntesis de nanopartículas magnéticas (NPM) a partir de una solución de FeCl3 y FeCl2. Las NPM se diseñaron con características específicas para la extracción de ácidos nucleicos y se estandarizó el protocolo de síntesis para obtener partículas de 5-20 nm de tamaño. Estas NPM se utilizaron para optimizar una metodología de extracción de ADN genómico bacteriano. Comparando esta metodología con las soluciones comerciales que emplean NPM o columnas de sílice, se logró reducir significativamente el tiempo de trabajo, lo que presentó ventajas evidentes en términos de eficiencia y ahorro de costos. No se necesitaba el uso de equipos costosos, como las centrifugas, lo que hacía que esta metodología fuera especialmente atractiva para aplicaciones en entornos con recursos limitados. La eficacia de este protocolo polivalente para la extracción de ADN se validó mediante la cuantificación del ADN utilizando espectrofotometría de luz UV. La electroforesis en gel de agarosa reveló la presencia de ADN íntegro y de alta calidad en más del 76% de las muestras analizadas, lo que subraya la utilidad de esta metodología en la obtención de ADN para su uso en diagnóstico y análisis genético. Un aspecto clave de este enfoque fue su polivalencia, ya que servía como base para la extracción de ARN y ADN plasmídico, ampliando aún más su utilidad en una variedad de aplicaciones de biología molecular. Esta versatilidad reveló que la síntesis autónoma de insumos es crucial para el diagnóstico y la investigación, reduciendo los gastos y el tiempo de espera en comparación con las metodologías comerciales convencionales. La capacidad de utilizar las mismas nanopartículas magnéticas para extraer tanto ácidos nucleicos como ADN plasmídico demuestra la versatilidad y el potencial de esta tecnología en diversas aplicaciones biotecnológicas. En última instancia, reconocemos que esta investigación no está exenta de limitaciones, y cada desafío encontrado ha proporcionado oportunidades para investigaciones futuras. La optimización de los protocolos de síntesis y extracción, así como la caracterización de las nanopartículas magnéticas, son áreas que merecen un seguimiento continuo. Además, la exploración de diferentes sistemas de sobreexpresión de enzimas también puede ofrecer nuevas perspectivas para mejorar la producción de Taq pol y otros componentes esenciales en biología molecular. Este trabajo no solo ha contribuido a abordar desafíos críticos en un contexto de emergencia sanitaria, sino que también ha sentado las bases para futuras investigaciones y avances en la dirección de la autonomía biotecnológica. Esperamos que inspire a la comunidad científica a continuar explorando nuevas vías de investigación y desarrollo en biotecnología y biología molecular, impulsando así la innovación en estos campos y fortaleciendo la capacidad del país para enfrentar desafíos futuros con recursos propios.